眾所周知,限制光學(xué)顯微鏡的放大倍數(shù)的主要因素是可見光的波長。為了解決這一問題,激光共聚焦顯微鏡問世了,但是激光共聚焦顯微鏡仍然尤其局限性。受激光波長的影響,它的分辨率也只能到達(dá)亞微米級別。但是越來越多的領(lǐng)域研究開始向著納米級別進(jìn)發(fā),這對于顯微鏡的發(fā)展又是一個(gè)新的挑戰(zhàn),人們開始尋找更小波長的光來代替激光,這個(gè)時(shí)候就出現(xiàn)了電子顯微鏡,利用電子束作為光源。但是電子顯微鏡雖然突破了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率限制,也限制了可觀察的樣品僅限于切片。在生命科學(xué)領(lǐng)域,很多時(shí)候需要用活細(xì)胞或者組織作為觀察樣本。這個(gè)時(shí)候,超分辨顯微鏡開始出現(xiàn)在人們的視野中。
超分辨顯微鏡是在激光共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上所拓展的技術(shù)手段。其利用的是受激發(fā)射損耗(STED)技術(shù)。在常規(guī)光學(xué)顯微系統(tǒng)當(dāng)中,由于光學(xué)元件的衍射效應(yīng),平行入射的照明光經(jīng)過顯微物鏡聚焦之后在樣品上所成的光斑并不是一個(gè)理想的點(diǎn),而是一個(gè)具有一定尺寸的衍射斑。在該衍射斑范圍之內(nèi)的樣品均會由于被照明光照射而發(fā)出熒光,使得該范圍內(nèi)的樣品細(xì)節(jié)信息沒有辦法被分辨,從而限制了顯微系統(tǒng)的分辨能力。而利用STED顯微技術(shù),可以有效減小熒光發(fā)光面積。一個(gè)典型的STED顯微系統(tǒng)中需要兩束照明光,其中一束為激發(fā)光,另外一束為損耗光。其主要是通過引入一束損耗光以受激發(fā)射的方式來抑制有效熒光的發(fā)射,從而實(shí)現(xiàn)超衍射極限的分辨率。
超分辨顯微系統(tǒng)的問世,無疑給生命科學(xué)研究領(lǐng)域帶來了極大的助力。使得活體樣本內(nèi)的動態(tài)成像成為了可能。
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